Vandprøver    

Vandprøver udtages en gang i måneden for bakteriologisk kontrol af drikkevandet i Nuuk. Kapisillit og Fiskenæsset får udtaget vandprøver i forbindelse med sundhedsvæsenets besøg ca. hver 3. måned

Prøverne kontrolleres især for coliforme bakterier , men også andre bakterier kan komme på tale, da det er overfladevand vi drikker.

Vandet undersøges  både før og efter der er tilsat chlor

Generelt er vandkvaliteten i Nuuk området fin , man skal dog være opmærksom på ,ikke at færdes på vore vandsøer, om sommeren er der oven i købet folk der kan finde på at bade i dem ,og hvem har lyst at drikke deres badevand ,eller Fido`s efterladenskaber, det er af en eller anden grund populært at lufte hund ved vandværkes ressoir.

 Colilert, gule felter = total koliforme

 E. coli giver fluorescens ved belyning af uv-lampe,kan desværre ikke ses rigtigt her.

 Sorte kolonier af Cl. perfringens,efter inkubation 24 timer anaerobt (uden ilt)

Fra jan.2007, centraliseres den mikrobiologiske kontrol af vandprøver på laboratoriet, Dronning Ingrids Hospital. Dette stiller store krav til forsendelsen, idet vandprøverne skal dyrkes indenfor 48 timer efter udtag - derfor skal disse sendes med kurerpost - så kan Blue Water rigtigt prøve deres navn i praksis.

Der kan læses meget mere om vandanalyser i det der følger 2 projekter et vedr. forsendelse og opbevaring. Et vedrørende E.coli som fækal indikator.

her et projekt udført af bioanalytikerstuderende Lea Hansen okt. 2006 vedr. opbevaring og forsendelse af vandprøver:

Resumé *

Indledning *

Problembaggrund *

Problemformulering *

Målformulering *

Teori/baggrundsviden *

Coliforme bakterier *

E. coli, og patogene bakterier *

Blå plade *

Colilert® *

Kimtal 37° C og 22° C *

Materialer og metoder *

Materialer *

Fremgangsmåde *

Pilotforsøg *

Resultater *

Diskussion *

Konklusion *

Klinisk Mikrobiologisk Afdeling i Nuuk skal fra 1. januar begynde at lave vandprøver fra hele kysten, til bakteriologisk analyse for fækal forurening af både råvand, drikkevand og produktionsvand. I den forbindelse skal vandprøverne sendes, og forsendelsen kan tage op til flere dage. Der vil så kunne ske en ændring af antal bakterier jo flere dage prøven opbevares, nogle arter vil formere sig, mens andre vil blive reduceret. Projektet vil forsøge at belyse hvad der sker med E.coli og kimtal under denne opbevaring. E.coli indikerer for en fækal forurening, og kimtallet kan sige noget om den generelle indhold af bakterier i vandet. Til at undersøge hvad der sker med E.coli bruges filtrering på en Blå plade og Colilert®, mens der bruges chokoladeplader til kimtal ved 22°C og 37°C.

Forsøget viser at E.coli falder meget i løbet af de første 3 dage efter tilsæting, mens kimtallet stiger drastisk. Det betyder at der kan forekomme både falsk negative og falsk positive resultater, hvis vandprøverne ikke udsås inden der er gået 3 dage.

Al drikkevand på Grønland er hentet fra overfladevand, dette fører til en større risiko for fækal forurening, både fra fugle, dyr og mennesker. Vise tarmbakterier kan være patogene for mennesker, så det er meget vigtigt at finde en fækal forurening af drikkevandet. Vandet undersøges regelmæssigt både før og efter klorbehandling. (1)

Klinisk Mikrobiologisk Afdeling på Dronning Ingrids Hospital i Nuuk skal fra 1. januar 2007 begynde at få tilsendt vandprøver fra kystens vandværker, taphaner i bygderne og fabrikkerne, til analyse for fækal forurening af vandet. Vandprøverne vil blive opsamlet af vandværket, hvorefter de vil blive sendt til KMA med posten i en flamingokasse med køleelementer i, så temperaturen er kold og konstant under transporten. Under denne forsendelse kan vandet være undervejs i op til flere dage grundet de lange afstande i Grønland og til tider vejret.

Hvis der er en fækal forurening i vandet vil der være forskellige fækale bakterier i vandet som kan være patogene. Disse bakterier skal findes og forsøges udryddet så befolkningen ikke bliver syge. Antallet af bakterier fundet i prøven skal derfor så vidt muligt afspejle antallet af bakterier i vandet, hvor prøven er taget fra.

Ved en transport af vandprøverne, der varer i længere tid vil nogle af bakterierne måske formere sig, sådan at der kommer et for højt antal i forhold til det faktiske antal. Andre vil måske dø under transporten, så der kommer et falsk negativt svar. Hverken den ene eller den anden mulighed er optimal, da et falskt svar vil kunne få negative konsekvenser for videre behandling af sagen. Det vil derfor være ønskeligt at finde ud af hvad der sker med antallet af bakterier ved en opbevaring af vandprøverne i 4 døgn.

Hvilke konsekvenser har en opbevaring af en vandprøve i længere tid, for resultatet af bakteriologisk analyse?

Jeg vil undersøge hvad der sker med kimtalet i en vandprøve taget fra en vandsø ved opbevaring i 5 dage. Denne opbevaring skal så vidt muligt tilsvare den opbevaring der sker under transporten af vandprøven. Denne sås ud på to chokoladeplader i henhold til vejledningen, en for hver dag prøven opbevares.

Jeg vil undersøge, hvad der sker med antallet af en kendt mængde tilsat E.coli i en vandprøve taget fra en vandsø ved opbevaring i 5 dage, der så vidt muligt tilsvarer den opbevaring der sker under transporten af vandprøven. Denne filtreres og sættes på en Blå plade, derudover laves der en Colilert®, én af hver for hver dag prøven opbevares.

 

Coliforme bakterier er en gruppe bakterier der alt efter definition indeholder forskellige antal slægter og arter. Den gamle definition indeholder 4 slægter og arter, der danner syre og luft ud fra laktose. Den nye definition indeholder ud over disse 4, 5 bakterier der ikke danner luft, men stadig danner syre ud fra laktose. En anden definition der er baseret på dannelsen af enzymet β-galactosidase, tilfører coliforme bakterier yderligere 6 bakterier. De mest gængse coliforme bakterier er dog fra den gamle definition – Escherichia coli, Klebsiella, Enterobacter og Citrobacter. (2)

Grænseværdierne for coliforme bakterier er 50 kim pr. 100 mL i råvandet, hvorimod der ikke må være nogen i drikkevandet.

E. coli er en bakterie, der sammen med mange andre bakterier er en del af normalfloraen i tyktarmen hos mennesker og varmblodede dyr. Den er ikke altid patogen i sig selv, men findes stort set altid ved fækal forurening. Den har kort levetid uden for tarmen, hvorfor den indikerer en nylig fækal forurening. E. coli er en forholdsvis stor gramnegativ stav på 1-2x0,5 μm, der fermenterer glukose, samt laktose og danner 2-3 mm store glatte, cirkulære kolonier, på blod- og chokoladeplader er de hvidlige til grålige, mens de kan tage farve af farvestoffet i en blå plade, så de bliver gule. (3,4)

De patogene mikroorganismer der kan være i drikkevand er forskellige tarmbakterier både fra mennesker og dyr. Det er både bakterier, protozoer og virus der kan forårsage vandbåren smitte. Bakterierne kan bl.a. være Salmonella og Yersenia. Symptomerne er oftest diarré, som kan være ledsaget af feber, kvalme og opkast.(4)

Grænseværdier for E.coli er max. 20 bakterier pr. 100 mL i råvandet, der må, som for total coliforme, ikke være nogen E.coli i drikkevandet.

Bruges til dyrkning og differentiering af gramnegative stave, grampositive bakterier bliver hæmmet af et detergent. Der er desuden en syreindikator i, brommethylenblåt, der slår om fra blå til gul ved syredannelse. Syredannelsen kommer, for E.colis vedkommende, ved forgæring af laktose.

90 % af alle stammer af E. coli er laktoseforgærende gramnegative stave, hvor der vokser store gule kolonier og indikatoren er slået om til gul. De sidste 10 % kaldes i daglig tale for blå coli, da de ikke forgærer laktose og derfor ikke bliver gule op en blå plade. (6)

Denne plade er en plade med 50 brønde, der efter tillukning er separate fra hinanden. 100 mL vand blandes med noget vækstmedie indeholdende ONPG og MUG og hældes i pladen, lukkes og sættes i varmeskab ved 37°C i 18-22 timer. ONPG er til at starte med farveløs. Den kan vha. enzymet β-galactosidase, som coliforme bakterier har, blive spaltet til et gult stof. E.coli har ud over β-galactosidase også enzymet β-glucoronidase, der kan spalte MUG, så det fluorescerer blåt. Dvs. hvis der er gule brønde efter inkubationen, er der coliforme bakterier, og hvis man lyser på pladen med UV-lys og de gule brønde fluorescerer blåt er der E. coli.

Antallet af positive brønde kan omsættes til det mest sandsynlige antal bakterier pr 100 mL, og et 95 % konfidensinterval for antal bakterier, ved hjælp af en tabel. (5)

Kimtal er de antal bakterier der vokser på en agarplade, evt. gær og skimmelsvamp tælles med. Kimtallet måles både for 37° C og 22° C. De bakterier der kan vokse i 37° C, er de bakterier der typisk vil kunne vokse i kroppen og evt. give infektion. Den siger noget om vandets mikrobiologiske kvalitet. Der må ved vand til produktion og vand til flaske eller anden emballage være max. 20 kim/mL ved 37° C. Kim der typisk findes i naturen vokser ved 22° C og er sjældent patogene. I vand på flasker eller anden emballage må der max. være 100 kim/mL.

I forsøget laves kimtallene på 2 chokoladeplader pr. prøve, hvor den ene sættes i varmeskab ved 37° C i 2 døgn og den anden stilles på bordet i laboratoriet, svarende til 22° C i 3 døgn. Der afsættes en ½ mL på pladen. En chokoladeplade er et generelt dyrkningsmedium, som tillader stort set alt at vokse. (4, 5, 6)

Rapporten er skrevet ud fra et eksperimentelt projekt, hvor der tilsættes en kendt mængde E.coli til noget søvand, hvorefter det står i flamingokasser og prøver udtages hver dag i 4 døgn. Materialet blev stillet til rådighed af Klinisk Mikrobiologisk Afdeling i Nuuk.

3-4 L søvand fra Nuuk vandsø

5 stammer E.coli

3 L målekolbe

3 reagensglas til fortyndingerne

4 flamingokasser med 2 køleelementer hver

4 flasker min. 200 mL

1 vandfiltreringsanlæg

6 filtre

6 Blå plader

6 Colilert®

12 chokoladeplader

Diverse podepinde

 

1. Start med at lave en filtrering, en Colilert® og to chokoladeplader af søvandet før tilsætning af bakterien(A). Dette er en nulprøve. Filtrering, Colilert® og en af chokoladepladerne stilles i 37°C og den anden stilles på bordet ved 22°C.

2. Der laves en Mac Farland 0,5, svarende til 10⁷ bakterier/mL(jf. pilotforsøg), af alle fem bakterier, med 0,9 % NaCl som opløsningsmiddel.

3. Derefter laves der en fortynding til 100 bakterier pr. 100 mL, denne skal være 3 L i slutvolumen:

§ tag 100 μL fra 10⁷ over i 10 mL 0,9 % NaCl, dette svarer til fortynding 10⁶

§ tag 100 μL fra 10⁵ over i 10 mL 0,9 % NaCl, dette svarer til fortynding 10⁴

§ tag 3 mL fra 10³ over i 3 L søvand, svarende til 100 bakterier pr. 100 mL

4. Fortyndingen med 100 bakterier deles i 4 flasker der kan rumme min. 200 mL, disse mærkes tirsdag-fredag og sættes i en flamingokasse med to køleelementer. Flamingokasserne stilles et sted ved stuetemperatur uden solpåvirkning.

5. Nu laves udsåningerne for hver dag, den første tages lige efter tilsætning af bakterien:

§ En filtrering, som sættes på en blå plade

§ En Colilert®

§ To udsåninger til kimtal på chokoladeplade

6. Filtrering, Colilert® og den ene chokoladeplade sættes ind ved 37°C og den anden stilles på bordet ved 22°C

7. Efterfølgende dag aflæses pladerne. Chokoladepladerne ved 37°C står dog i to døgn inden endelig aflæsning, og chokoladepladen ved 22°C aflæses først efter 3 døgn.

 

For at komme frem til punkt 3 i fremgangsmåden har jeg lavet pilotforsøg. Dels for at øve mig på teknikkerne bag filtrering og Colilert® og dels for at lave fortyndingerne korrekt.

Fortyndingerne blev lavet ud fra en Mac Farland 0,5 der i teorien svarer til 10⁸ bakterier pr mL, men ved dette pilotforsøg fandt vi at Mac Farland 0,5 for denne E. coli er 10⁷ bakterier pr. mL, da vi ved et af forsøgene efter fortynding svarende til punkt 3 i fremgangsmåden, fandt ca. 50 kolonier pr. 100 mL, hvor den teoretiske værdi for den normale Mac Farland 0,5 ville være 500 kolonier pr. 100 mL, dvs. at der var koncentration af bakterien der var 10 gange mindre end forventet. Denne forskel kan skyldes at E. coli er forholdsvis store bakterier, og da Mac Farland er et mål for hvor sløret en bakterieopslæmning er, skal der ikke så mange bakterier til at lave samme sløring, som hvis det var en lille eller gennemsnitlig bakterie. Desuden kan der ved udtagelsen af bakterierne fra agarpladen været kommet lidt agar med over i opslæmningen.

Generelt passer antal fundne baktrier på filtreringen og Colilert® rimelig godt overens med hinanden, da antal gule kolonier på filteret på den blå plade ligger nogenlunde inden for 95 %-konfidensintervallet af Colilert®. Dog stemmer udsåningerne fra det "rene" søvand, prøve (A), ikke helt overens med hinanden, hvor der på den blå plade er ca. 25-30 gule kolonier mod kun 3 positive felter på Colilert®. Ud fra teorien er det Colilert® der giver det rigtige antal coliforme bakterier, da den er mere specifik for coliforme bakterier i forhold til den blå plade, dette pga. enzymet β-galactosidase der er specifik for coliforme bakterier. Den blå plade indikerer coliforme bakterier ud fra syredannelse efter laktoseforgæringen og der kan måske være andre bakterier end lige de coliforme der kan danne syre og blive gule på en blå plade.

Ved aflæsning af Colilert® 1 døgn(C), lyste vi ikke på pladen med UV-lys. Vi burde have belyst pladen, da vi ikke kan vide om felterne indeholder E.coli eller coliforme bakterier. Vi lyste ikke på den, da vi ikke troede at mængden af E.coli ville falde så hurtigt efter 1 døgn, hvor alle felterne fluorescerede. Også fordi der på filtreringen var lige mange kolonier på 0. og 1. døgn. Men aflæsning af pladen efter 2 døgn(D) viste at der kun var 19,2 E.coli-bakterier/100 mL tilbage, og vi kan så formode at der på 1. døgn(C) har været et antal af E.coli der ligger mellem 19,2 og op over 200 pr mL.

I forhold til kimtal på både 37° C og 22° C er temperaturen af vandet meget vigtig. Dette kan ses på de sidste to dage, prøve E og F, hvor temperaturen var på 18° C ved udsåning af vandprøverne. Her er kimtallet på 22° C steget til over 1000 på 3. døgn og over 5000 på 4. døgn i forhold til 420 kim på 2. døgn, hvor temperaturen kun var på 10° C. Det sammen sker ved den på 37° C efter 4 døgn, hvor der var 174 kim i forhold til 16 på 2. døgn. Det viser også at de flamingokasser jeg har opbevaret prøverne i, ikke kan holde vandet koldt nok i mere end 3 dage.

Formodentlig har den samme temperaturstigning også en lille indflydelse på total coliforme, da der sker en stigning fra 129,2 bakterier til over 200.

Hvis man kigger på alle tallene, sker der meget ved efter 2 døgns opbevaring af vandet. Ved filtrering falder antal kolonier til det halve, på Colilert® stiger antal coliforme bakterier fra 3 ved det "rene" vand til ca. 110(129,2 total coliforme – 19,8 E.coli), samtidig med at E.coli falder fra over 200 bakterier til ca. 20. Derudover begynder kimtallene at stige en del især ved 22° C. Disse observationer viser at vandprøver der ældre end 2 døgn vil kunne give både falsk negative og falsk positive resultater. De falsk negative resultater kan fremkomme efter en nylig fækal forurening af vandet, eftersom E.coli ikke kan leve så lang tid i vandet. Hvis der f.eks. var 30 E.coli i prøven fra starten vil dette tal teoretisk være faldet til 3 efter 2 døgn. Dette er ikke optimalt da der max må være 20 E.coli i råvand og et resultat på 3 vil blive rapporteret som et negativt prøveresultat, men der kan stadig være patogene bakterier, som f.eks. Yersenia og Salmonella i vandet, borgerne kan blive syge af.

For total coliforme bakterier vil der kunne afgives en falsk positivt svar, da der kun må være max 50 bakterier i råvandet og 3 bakterier i en prøve tilsyneladende kan formere sig til 110 bakterier på 2 døgn. Derudover vil falsk positive prøver kunne fremkomme ved vandprøver fra produktionsvand og flaskevand, hvor der også kigges på kimtallene. Kimtallene ved 22 °C stiger fra 160 ved prøve A til 420 efter 2 døgn. Dvs. hvis der var 50 kim ved opsamling vil der i teorien være ca. 130 kim efter 2 døgns opbevaring. Dette resultat vil blive rapporteret som et positivt prøveresultat, da der kun må være 100/mL ved 22° C, men er en falsk positiv resultat.

Vandprøver bør ikke analyseres for bakterier hvis de har stået i mere end 2 døgn. Dette fordi antal fundne bakterier vil være for usikker. Indikatorbakterien for fækal forurening, E.coli, falder meget efter 2 døgns opbevaring, og kimtallene begynder at stige. Det betyder at der både kan forekomme falsk negative og falsk positive resultater, hvis vandprøverne ikke udsås inden der er gået 2 døgn efter opsamling af vandprøverne. Konsekvensen er at vandprøver fra kysterne helst skal tages samme dag, som de skal sendes, i betragtning af de lange afstande i Grønland der tit fører til lange transporttider.

Derudover bør temperaturen også forsøges at holdes lavt og konstant under hele transporten. Fordi der sker en voldsom stigning af kimtallet ved 22° C og antal total coliforme bakterier, ved en temperaturstigning fra 10-18° C.

Prag, J. et al, "Bakteriologi i Grønland" 1996

Hjemmesiden som Peter havde

Degré, M. et al, "Medicinsk Mikrobiologi", 2. udgave 2000, 2. oplag 2002, Gyldendal Norsk Forlag AS, Olslo

Miljøstyrelsen, "Vejledning om håndtering af overskridelser af de mikrobiologiske drikkevandsparametre", vejledning fra miljøstyrelsen Nr. 4 2004

Laboratorievejledning for vandlaboratoriet, KMA i Nuuk

Statens Serumsinstitut, "Substrathåndbogen", 1. udgave 1993

.

 Her en præsentation af bioanalytikerstuderende Karina Clod Asmund, i gang med eksamensprojektopgave, E. coli som fækal indikator i Grønland. Jeg er stolt af at få lov at vise Karinas opgave på denne side, den har fået en fin bedømmelse i DK og her, så det er dejligt at andre kan få lov at kigge med.       

 I rør ses mpn,metode, forrest membranfiltermetode

 E. coli , membranfiltrering.

Resumé:

E. coli hører under betegnelsen termotolerante bakterier, og er tegn på fækal forurening, ved tilstedeværelse i drikkevandet. Denne og andre bakterier som Escherichia, Shigella, Salmonella, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter, og Proteus bruges som indikator bakterier ved forurening af drikke vandet. For at påvise disse, benyttes der, ifølge dansk standard to individuelle metoder; MF- metoden (membran-filtrations metoden) og MPN- metoden (Most Probable Number) til påvisning af henholdsvis enterokokker og E. coli. I Grønland har man valgt at udvide MF-metoden, så man kan nøjes med denne. Dog er det et problem, hvis pladerne skal indkuberes ved 44˚C straks efter filtreringen af vandet, da bakterierne er meget kolde på grund af vandtemperaturen om vinteren, og vil derfor få et chok ved en direkte påvirkning af 44˚C. Men ved MF- metoden kan en vækst tydelig ses, og antal af kolonier kan tælles, selv de laktose negative bakterier. Ved MPN- metoden ser man efter et farve omslag i agaren ved vækst. Men dette vil man ikke se, ved laktose negative bakterier.

10 udvalgte E. coli stammer påvirkes ved forskellige temperaturer ved forskellige tider, for at se deres reaktion som det ville være i forhold til sommer og vinter, og de to metoder sammenholdes. Samtidig sammenholdes dansk standard metode med Grønlands udvidet MF-metode.

E. coli stammerne blev tydeligt svækket ved meget lave temperaturer, og ved påvirkning i længere tid var der slet ingen vækst af bakterier. De to dansk standard metoder fandt næsten det samme antal total koliforme bakterier i samme prøve, men MF- metoden har et mindre interval, og derfor mere præcise aflæsninger. Grønlands MF-metode er langt hurtigere end dansk standard metoder, og mere overskueligt. Den er god til at påvise E. coli, og gør det lettere at se laktose negative E. coli, da de gror frem på filtret, og ikke er en blandet "suppe" med mange andre bakterier i MacCONKEY agar glassene.

I Det Ny Testamente fortælles der om livets vand, som kommer fra Jesus, og som skal blive til - et kildespring til evigt liv - (Johannes-evangeliet 4, 14). Vi har siden skabelsen opfattet vand som noget helligt og magisk, noget som kan opvække døde, skænke livsfornyelse eller endog give udødelighed.

Det er ikke kun i den Kristne tro at vandet bærer mystik, for det kendes fra flere kulturer, bl.a. fra babylonisk og ægyptisk mytologi, hvor vandet også opfattes som den livgivende kilde.

Men bag de klare og blanke dråber, udspringer en hel anden verden, en den man tror. Vandet er langt mere end livets kilde, og indeholder desværre undertiden farlige kemiske stoffer og mikroorganismer, som der undersøges for verden over.

I Danmark har alle mulighed for at få godt og rigeligt vand, men nogle af de største trusler mod menneskets helbred er manglen på ordentlige sanitære forhold og godt vand. Det er derfor et krav fra sundhedsministeriet, at der løbende undersøges for fækal forurening i drikke vandet, da bakterier og virus i grundvandet kan have patogen betydning. De fleste mikroorganismer er uskadelige for mennesker og dyr, men der findes et betydeligt antal, der er patogene. Påvisning af E. coli i drikkevand er normalt tegn på frisk fækal forurening og dermed en risiko for tilstedeværelse af mulige patogene bakterier. (7)

Sådanne forureninger påvises på flere forskellige måder, over hele verden. I Grønland bruges membran-filtrations metoden ( MF-metoden ) til påvisning af termotolerante bakterier i drikkevandet (17). Hvorimod EU-lande bruger MPN-metode ( most probable number ) til denne påvisning.

Dansk vandbehandling er generelt meget simpel, da mere end 99% af vandforsyningen er baseret på grundvand, og kun et enkelt vandværk producerede i 2000 regelmæssigt drikkevand fra overfladen. Det er desuden karakteristisk, at vandbehandlingen som regel omfatter sandfiltrering, og at vandet kun desinficeres i meget få tilfælde. Men dette er ikke tilfældet i Grønland, da drikke vandet er overfladevand, og der er derfor langt større risiko for forurening. Det er derfor vigtigt med en præcis metode til påvisning af fækal forurening.

Inden vandet flyder fra vores vandhaner skal de gennem flere filtreringer, og behandlinger, så vi er sikre på at det vand vi indtager ikke er forurenet. En sådan forurening af drikkevandet kunne skyldes en fækal bakterie, som eksempelvis en E. coli.(11) (12)

I øjeblikket anvender man på Klinisk Mikrobiologisk Afdeling (KMA) i Grønland, en MF-metode til påvisning af eventuel fækal forurening i drikke vandet. Denne metode er godkendt i Grønland, men ikke i EU lande. Ved MF-metoden filtreres vandprøverne direkte fra opsamlings temperatur (2-3° C) og dyrkes til 44° C (17).

I Grønland ligger vandet tilgængeligt som overfladevand, og der er større sandsynlighed for forurening, da menneskene kan finde på at bade i det, eller hundene luftes i nærheden.

Smitte af fækale patogene bakterier via drikkevandet, kan fremkalde alvorlige sygdomme som diare og opkast hos mennesker. Det er derfor et krav fra sundhedsministeriet at man skal kunne påvise helt ned til 1 bakterie pr. 100 ml. vand, ved hjælp af MF-metoden eller MPN-metoden) som er godkendt af sundhedsministeriet.

Grunden til at man i Grønland benytter MF-metoden er, at den er nemmere at udføre, da der ikke kræves 15 glas eller derover, for at få et resultat.

Når vandprøverne er samlet ind, skal de umiddelbart efter filtreres og straks dyrkes ved 44° C. Ved denne temperatur kan man ifølge forskriften (15), påvise den termotolerante E. coli, der skal kunne fermentere laktose ved denne høje temperatur (17). Denne bakterie er en indikator bakterie på fækal forurening, og patogene organismer som Hepatitis-virus, enterovirus, parasitter, salmonella, Vibrio cholerae, Shigella, entero-patogene E. coli, kan forsage sygdomme som diare. Grunden til at man leder efter E. coli i vandet er, at denne ikke lever frit i naturen, men er der sket en fækal forurening, vil der være store mængder af denne i forhold til andre patogene, da E. coli lever i tarmen.

Dog kunne man forestille sig, at nogle E. coli stammer vil få et chok, og ikke kan vokse frem ved en pludselig opvarmning til 44° C, da vandprøverne her på Grønland ofte er nær frysepunktet, og bakterierne ligeså. Under pilot forsøg (se materialer og metoder), undersøgte vi forskellige vækst forhold for E. coli.

For at undgå falsk negative svar, kunne man undersøge, om forskellige opvarmningsmetoder sikrer vækst af tilstedeværende E. coli, og hvor lang tid pladerne med filterpapiret på, skal stå ved forskellige temperaturer, for at opnå en acceptabel vækst.

Hvilken påvirkning har en pludselig temperaturstigning fra 0-3° C til 44° C på udvalgte E. coli?

Hvilken forskel ses der i antal kolonier, ved at forvarme pladerne med filtre ved stuetemperatur og 37° C, i forhold til en direkte opvarmning til 44° C?

Hvor mange timer skal der forvarmes på de pladerne med filtre ved stuetemperatur og ved 37° C, før der ses en forskel i antal af kolonier på vækstpladerne ved direkte opvarmning til 44° C?

Hvilke fordele og ulemper er der ved MPN- og MF-metoden?

Dette er en prospektiv undersøgelse, udført i perioden 28/11-2003 til 16/12-2003. Undersøgelsen er udført på 10 kendte E. coli, som blev isoleret fra tilfældige urindyrkninger og testet for vækst ved 44˚C. De blev fortyndet ud fra en Mac Farland 0,5, og videre til opløsninger svarende til 10² og 10⁴. Vi valgte at påvirke de forskellige stammer på forskellige måder, med forskellige tider og temperaturer. Her efter kunne vi sammenholde reaktionerne, og se hvilke forhold E. coli lever bedst under og dårligst under. Samtidig havde vi forskellige forhold for bakterierne, som vi kunne sammenholde med sommer og vinter i Grønland, hvilket jo også har stor betydning for bakterier i vandet, og deres overlevelse.

Vand udg¢r ca. 70% af legemet og spiller en stor rolle i blodcirkulation og ford¢jelse samt udskillelse og indtagelse af stoffer. Selv en del af skelettet består af vand. Derfor er det livs- vigtigt at indtage en vis mængde vand hver dag (18). Når drikkevandet er taget fra overfladen, er der imidlertid stor risiko for forurening af, for når sneen og isen smelter i Grønland, frigøres enorme vandmasser i løbet af ganske kort tid. Vandet flommer ned ad fjeldsiderne, ud i søer og elve, hvorfra noget af vandet føres i rør ind til vandværkerne (11).

I vintertiden sker omsætningen i naturen langsomt. Det betyder, at blade og rester af dyr, bl.a. ekskrementer, næsten ikke er omsat, når forårsflommen sætter ind. En væsentlig del af disse plante- og dyrerester kaldes humus.

Med forårsflommen føres store mængder humus og silt (humus og silt har en kornstørrelse mindre end sand) med vandet til vandværkerne, hvor disse små kornstørrelser ikke kan tilbageholdes i vandværkernes sandfiltre. Derfor oplever forbrugerne især i flomtiden, at vandet i vandhanerne kan være gulbrunt. Denne misfarvning har dog ingen sundhedsmæssig betydning.

I alle byer bliver vandet kloret for at bekæmpe skadelige bakterier i drikkevandet på vandværkerne. Når indholdet af humus og silt er højt, kan der i forbindelse med kloringen dannes de såkaldte trihalomethaner. Trihalomethaner mistænkes for at være kræftfremkaldende, hvorfor der er god grund til at forsøge at hindre dannelsen af disse stoffer. Dette gør man ved at tilsætte aluminiumsulfat til vandet, samtidig med at det blandes med luft. Derved samles aluminiumsaltet, humus og silt i "flokke", som kan filtreres fra. Først derefter bliver vandet kloreret. Når humussen og silten fjernes først er det for ikke at få dannet trihalomethan forbindelserne (12, 20)

Før og efter kloringen undersøges vandet for indikatorbakterier der ses ved fækal forurening. Her menes en forurening med mikroorganismer som eventuel kan forsage sygdomme. Endvidere er E. coli og enterokokker en naturlig del af den fækale flora hos mennesker og dyr og dermed også del af bakteriefloraen i levnedsmidler og vand, der er fækalt forurenede (20).

En række sygdomsfremkaldende mikroorganismer kan sprede sig via vand. I den rutinemæssige overvågning af vands hygiejniske tilstand er det ikke praktisk muligt at undersøge for alle stoffer. I stedet anvendes bestemmelser af indikatororganismer, hvorved forstås mikroorganismer, der forudsættes altid at kunne forekomme sammen med sygdomsfremkaldende mikroorganismer, og at være mindst lige så resistente som disse i det vandige miljø (1).

Dette kan være termotolerente E. coli og koliforme stave. Det er næppe muligt at analysere for alle patogener i en vandprøve, og nogle organismer (f.eks. vira og parasitter) er det vanskeligt at analysere for. Derfor disse analyser for indikatororganismer, og hvis de er tilstede, er der en vis sandsynlighed for, at prøven har været udsat for forurening, f.eks. fækal forurening.

Der undersøges for koliforme bakterier og ved positive fund af disse organismer bliver der også analyseret for termotolerante koliforme, der i højere grad indikerer en fækal forurening (12).

Koliforme bakterier omfatter en gruppe gram-negative, morfologisk og biokemisk nært beslægtede bakterier, som findes naturligt i jord, forrådnede planter og i tarmen, men ikke i drikkevandet. Dette kan være Escherichia, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter, med flere (22). Tilstedeværelsen af koliforme bakterier i drikkevandet betyder derfor på en forurening - typisk fra overfladevand. Denne gruppe er som regel ikke sygdomsfremkaldende i sig selv, men trives samme steder som sygdomsfremkaldende bakterier. De kan fjernes - eksempelvis ved kogning, men årsagen til fækal forurening skal findes. (2, 5, 13)

E. coli er udbredt som tarmparasit hos mennesker, dyr og fugle, og forårsager dermed ikke sjældent sygdom, men de tarm-patogene kan fremkalde diare. E. coli er ikke frit-levende i naturen. Forekommer den i badevand eller drikkevand, tages det som udtryk for fækal forurening af vandet. E. coli er en gram negativ stav, der som regel er bevægelig, og danner syre og luft fra sukkerarter og 89 % E. coli fermenterer laktose, 94% af alle E. coli er positive for indol (15). Den vokser bedst ved 8-37ºC. . For hurtig nogenlunde adskillelse af E. coli fra andre koliforme bakterier i vandet, anvender man dens evne til vækst, forgæring af laktose, og dannelse af indol ved 44˚C, til forskel for de andre bakterier (3, 13). Denne kaldes for termotolerant koliform bakterie eller termotolerant E. coli. Findes den i drikkevandet, er der sandsynlighed for at der også findes patogener som Hepatitis-virus, enterovirus, parasitter, salmonella, Vibrio cholerae, Shigella, entero-patogene E. coli, som kan forsage sygdomme som diare (3, 13).

Termotolerante koliforme bakterier er ikke i sig selv sygdomsfremkaldende, men en forurening med disse bakterier tyder på en frisk forurening af drikkevandet, der stammer fra husspildevand, dyregødning eller lignende, og dette kan give sygdomme som diare (2). Smittes man med en patogene mikroorganismer som er kommet uden for tarmen, indtaget med føde eller drikkevandet, er der tale om en vehikelbåren smitte. Hvis der er tale om en tarm-patogen E. coli kan dette blandt andet medføre mavegener som opkast og diare, som er en mave tarm sygdom der medfører tynd hyppig afføring i store mængder. (3, 9). Det er en sikkerhed at vide, at man i EU lande og Grønland har klare retningslinier om, hvorvidt der må findes bakterier i drikkevandet og hvor meget. Til et bestemme dette, benyttes der forskellige metoder, der viser en eventuel forurening af drikke vandet.

Enterokokker er tarmbakterier (fækale streptokokker), og forekomst jndikerer lige som E. colj, fækal forurening af vand. Efter en overgangsperiode på to år måles enterokokker kun ved forekomst af E. coli. (20, 21) Den kan vokse på telluritholdige substrater, da de reducerer tellurit til tellur og herved danner sorte kolonier. Enterokokker benyttes også som indikator bakterie, men ved en fækal forurening vil der oftest se større mængder af E. coli (3).

En gang hver måned tages der vandprøver på Grønland, til kontrol af fækal forurening. Disse prøver opsamles af en mand fra vandværket og Peter Poulsen; mikrobiologi. Prøverne opsamles i autoklaverede flasker, tilsat natriumtiosulfat 10%, fra ca. 8-9 steder i Nuuk og Nuussuaq. Der tages prøver fra både råvand, behandlet vand og fabrikker med fisk. Før opsamlingen skal vandet løbe nogle minutter, så det opnår den rigtige temperatur der måles ved opsamlingen. Denne noteres sammen med tidspunkt, og hanen "brændes" med en gasflamme, for at dræbe udefra kommen forurening. Prøverne transporteres hurtigst muligt til laboratoriet, hvor tid og temperatur noteres, og prøverne bearbejdes.

Ved MPN-metode bestemmes antallet af koliforme bakterier. Ud fra kombinationen af rør med syre og luft beregnedes MPN-værdien, korrigeret for de undersøgte prøvemængder. Ved MPN forstås det statistisk beregnede antal mikroorganismer, der kan påvises i en dyrkningsbouillon. Der udsås i tre rækker af fem rør. Disse tilsættes flydende selektivt laktoseforgæringssubstrat (bilag 2 samt billede a. bilag 4). Ved vækst af koliforme bakterier dannes syre og luft, og substratet slår om fra lilla til gul. De positive isoleres til 44˚C i nye rør. (1, 4).

En anden måde at undersøge for fækal forurening i vandet, er membran filtreringens metoden. Ifølge Dansk standard (8) bruges denne til påvisning af enterokokker. Her filtreres til en slanetz plade for isolering af enterokokker, hvor de ses som røde kolonier, da de omdanner tetrasoliumchlorid efter inkubation ved 37ºC i to døgn (8, 12, 17).

Men på Grønland har man valgt en udvidet form for MF-metoden (15). Her filtrerer man en given prøvemængde og dyrker derefter de tilbageholdte mikroorganismer på filtret, på en blåplade(SSI), og dyrkes ved 44˚C. Derefter kan antallet af fækal koliforme kolonier tælles. Er der vækst af fækal koliforme bakterier, isoleres disse til API bestemmelse, og her skal de kunne danne indol ved 44˚C og eventuel forgære laktose, og der stilles diagnosen som termotolerante E. coli bakterier. (4, 7) Der filtreres ydermere til en slanetz plade for isolering af enterokokker, hvor de ses som røde kolonier, da de omdanner tetrasoliumchlorid efter inkubation ved 37ºC i to døgn (12, 17).

Det forventes fra begge metoder, at selv meget små mængder fækal forurening findes. Se nedenstående skema over grænseværdier for bakteriologiske parameterværdier (10).

Skema 1. Grænseværdier for bakteriologiske parameterværdier (10).

Der må ikke være total koliforme, fækal koliforme eller E. coli bakterier i det behandlede vand.

Er et selektivt medium til dyrkning og differentiering af gram negative stave, fortrinsvis Enterobacteriaceae.

Modificeret udgave af medium oprindeligt beskrevet af MacConkey. Selektiviteten skyldes indholdet af galdesalte, der hæmmer væksten af de fleste grampositive bakterier.
Forgæring af laktose medfører syredannelse, hvilket får indikatoren, til at slå om til gul.

Komponenterne blandes og efter opløsning indstilles pH på 7,4. Der tilsættes 2 ml. af en 1% alkoholisk bromcresolpurpuropløsning til substratet af enkelstyrke, 4 ml. til dobbeltstyrke (1).

Er også et selektivt og indikativt medium til dyrkning og differentiering af gramnegative stave, fortrinsvis Enterobacteriaceae. Selektiviteten skyldes et overfladeaktivt stof (detergent), der hæmmer væksten af grampositive bakterier. Detergenten hæmmer desuden Proteus arter i at sværme. Forgæring af laktose medfører syredannelse, hvilket får indikatoren, bromthymolblåt, til at slå om fra blå til gul (9, 16).

I en Canadisk undersøgelse; "Canadian Shellfish Quality Resource", hvor der blev undersøgt for fækal forurening på vand fra Shellfisk yngle områder, blev MF-metoden og MPN- metoden anvendt. I undersøgelsen fandt man, at MF- metoden giver et bedre resultat, da man kan tælle kolonierne. Her leder man også efter indikator bakterier som kan spore hen på en fækal forurening (13).

En anden undersøgelse fra Columbus, Ohio,1996 af Donna S. Francy, Teresa L. Hart, and Cathy M. Virosteck viser, at man ikke kan påvise at man ikke kan finde bakterier dyrket i kloret vand (14).

Der var tre formål ved pilot forsøget.

at finde en passende opløsning bakterier pr. ml vand, så kolonierne kunne tælles.

at finde et velegnet fortyndingsmiddel; Postevand, natrium klorid eller demineraliseret vand.

at se om der var forskel i væksten ved 37˚C og 44˚C.

Postevand blev indsamlet fra laboratoriets vandhane, og blev hældt på 200 ml flaske med Natriumtiosulfat 10%, som binder klor fra postevandet.

En E. coli blev opslæmmede til en Mac Farland o,5 i postevand, og der blev overført 100 m l med pipette til et glas med 10 ml postevand, hvilket svarede til 10^6 bakterier/ml vand.

100 m l blev overført til glas med 10 ml postevand, hvilket svarede til 10^4 bakterier/ml vand.

100 m l blev overført til glas med 10 ml postevand, hvilket svarede til 10^2 bakterier/ml vand.

Fra det sidste glas blev der overførte 60μl til 600 ml vand, svarende til 1 bakterie pr 100 ml.

Fra det sidste glas blev der overførte 0,6 ml til 600 ml vand, svarende til 10 bakterier pr 100 ml.

Fra det sidste glas blev der overført 6,0 ml til 600 ml vand, svarende til 100 bakterier pr 100 ml.

Dette blev gentaget, blot hvor postevandet blev byttet ud med demineraliseret vand og bagefter med natrium klorid.

Alle 3x3opløsninger blev filtreret i hver deres tragt med filtre, to gange. (se bilag 1)

Filtret blev aftaget fra tragten med steril pipette, og lagt på to blå plader (SSI).

Den ene blev dyrket ved 44 ° C den anden blev dyrket ved 37 ° C.

Dagen efter blev alle pladerne aflæst for vækst, og noteret.

For at undersøge teorien om, at E. coli ville dræbes ved brug af postevand med klor, hvis ikke der blev tilsat natriumtiosulfat 10%, lavede jeg en flaske med rent postevand, på samme måde som ovenfor beskrevet punkt 2 til 7. Dette blev filtreret od dyrket på samme måde som i punkt 9-12.

Da jeg i forsøget som sagt har lavet mange små opbyggende undersøgelser, har jeg valgt at dele dem ind efter numre.

Her brugte jeg vand som vi havde opsamlet i en sø. Vi viste fra andre målinger, at den var forurenet med E. coli.

1. Da jeg kom hjem med sø prøven, som var 0˚C ved opsamlingen, blev temperaturen målt til ca. 6˚C, ca.2-3 timer efter.

2. 100 ml. blev filtreret 6 gange, og filtrene blev lagt på hver deres blå plade (SSI).

3. Den ene blev sat i 37° C og den anden i 44° C i to døgn, en plade stod ved stue temperatur i 3 timer, før den kom i 44˚C i to døgn, de sidste tre stod ved 37˚C i henholdsvis 1, 2 og 3 timer før de kom i 44˚C i to døgn.

4. Flasken med søvand blev sat på køl i et døgn. Dagen efter blev temperaturen målt til ca. 6° C igen, og forsøget blev gentaget for at se, om bakterierne kunne holde sig et døgn. Dette er af betydning, da nogle prøver sendes ind til vores laboratorium, og er et døgn undervejs før de filtreres. Resultatet var det samme, så jeg har kun tilføjet et skema. Se resultater.

5. Vækst af total koliforme bakterier ved 37˚C, isoleres til 44˚C, hvor der laves en API test på dem, for at se om de danner indol.

 

Prøvemængder på 5 x 10 ml McConkey Bouillon (dobbelt koncentration agar ) tilsættes 10 ml søvand, 5 X 10 ml McConkey Bouillon ( enkeltstyrke ) tilsættes 1 ml søvand, 5 X 10 ml McConkey Bouillon ( enkelt styrke) tilsættes 1 ml fortynding til 10 ^–1 søvand. ( se forklaring nedenfor ).Herefter blev rørene inkuberet ved 37°C og aflæst efter 1 og 2 døgn. (bilag 4 a.)

Her benyttes samme søvand som ovenfor, og det har fået samme behandling.

Enkeltstyrke agar: 20 g. agar pulver blandes med 500 ml. demineraliseret vand.

Dobbeltstyrke agar: 10 g. agar pulver blandes med 125 ml. demineraliseret vand.

Fortynding 10^-1 : 1 ml. søvand med E. coli tilsættes 9 ml. sterilt vand.

Der laves tre rækker med glas:

Række: 5 stk. 20 ml glas tilsættes 10 ml dobbeltstyrke agar. Tilsættes 10 ml. søvand med forurening af E. coli.

Række: 5 stk. 10 ml. glas tilsættes 10 ml. enkeltstyrke agar. Tilsættes 1 ml. søvand med forurening af E. coli.

Række: 5 stk. 10 ml. glas tilsættes 10 ml. enkeltstyrke agar. Tilsættes 1 ml. fortynding 10^-1 søvand med forurening af E. coli.

 

For at undersøge, hvor meget natriumtiosulfat 10 % der skal til, for at binde kloret i postevandet vandet, således at jeg kunne få vækst på pladerne ved brug af postevand, laves dette forsøg.

Der blev lavet tre opløsninger med 1000 ml. postevand i hver svarende til 50 bakterier pr 100 ml vand.

Der blev tilsat henholdsvis

· 1 ml. natriumtiosulfat 10%

· 5 ml. natriumtiosulfat 10%

· 10 ml. natriumtiosulfat 10 %.

Opslæmningerne blev målt til ca. 8˚C kort efter opslæmningerne var lavet,

Der blev filtreret 100 ml af hver opløsning to gange, og filtrene ligges på en blå plade (SSI) hver, hvor den ene blev dyrket ved 37° C og den anden ved 44 ° C i et døgn.

Pladerne blev aflæst for kolonier. (bilag 4 b.)

1. Der udvælges 1 E. coli som opslemmes til 600 ml. ved 4 forskellige koncentrationer:

· 1 bakterier/100 ml. = 60 m l af 10^2 opslæmning/600 ml. postevand

· 10 bakterier/100 ml. = 0,6 ml af 10^2 opslæmning/600 ml. postevand

· 50 bakterier/100 ml. = 3 ml af 10^2 opslæmning/600 ml. postevand

· 100 bakterier/100 ml. =6 ml af 10^2 opslæmning/600 ml. postevand

Disse skal alle have en temp. på 2-3° C.

 

2. Hvert sæt deles i 6 "portioner" af 100 ml hver ( dvs. 4x6 prøver ), og mærkes 1-6 af hver opslæmning.

3. Prøve 1 fra hver opslæmning blev filtreret, filtret blev lagt på en blå plade (SSI) og pladerne stilles ved stue temperatur i en time, hvorefter pladen blev dyrket ved 44° C i to døgn.

Prøve 2 fra hver opslæmning blev ud sået på samme måde og stilles ved 37° C i en time inden de dyrkes ved 44° C.

Pladerne nr. 3 for hver opslæmning stilles i tre timer ved stue temperatur, inden de dyrkes ved 44° C.

Prøverne nr. 4 stilles ved 37° C i tre timer inden de dyrkes ved 44° C.

Plade 5 og 6 blev dyrket direkte ved henholdsvis 37° C og 44° C.

E. coli nr.1 blev opslæmmet til en Mac Farland o,5.

100m l blev udtaget over i et sterilt glas med 10 ml. natriumklorid, der blandes godt.

100m l blev udtaget fra denne fortynding, over i et sterilt glas med 10 ml. natriumklorid, hvilket blandes godt.

200 m l blev udtaget og tilsat til 20 ml natriumklorid. i et sterilt glas. Dette skulle nu svare til en opløsning 10² kolonier pr. ml.

Fem flasker, tilsat natriumtiosulfat 10%, i fire af dem blev der fyldt 600 ml. postevand, og i den 5. flaske 600 ml. demineraliseret vand.

I flaske 1. blev der tilsat yderligere 60 m l af min 10²-opløsning, og blandede godt.

I flaske 2 blev der tilsat 0,6 ml af min 10²-opløsning, og blandede godt.

I flaske 3 blev der tilsat 3 ml. af min 10²-opløsning.

I flaske 4 blev der tilsat 6 ml. af min 10²-opløsning.

I flaske 5 med demineraliseret vand blev der tilsat 3 ml. af 10²-opløsningen. Denne skulle bruges som kontrol på, at E. colien kunne vokse frem.

Flaskerne blev sat i køleskabet i ca.3 timer og temperaturen blev målt til 8° C inden det blev filtreret til 6 blå plader (SSI). Disse plader blev behandlet forskelligt. Se ovenstående.

100m l af min 10²-opløsning blev udtaget med pipette og dyrket på en blå plade(SSI), for at kunne tælle det antal kolonier pr. ml som opslæmningen svarede til, efter et døgn ved 37 ° C.

Grunden til at vi vælger de høje koncentrationer, er for at opnå bare lidt vækst ved 44 ° C

 

Under forsøg 6) lavede jeg en ekstra flaske 50 E. coli/100 ml.

Denne flaske filtrerede vi 100 ml af, hver time, ved 1, 2 og 3 timer. Løbende stod flasken i sne ved minus 2 grader, for at køle den ned. Her ville vi se, om en sådan nedkøling havde indflydelse på antal af kolonier. Se skema 5).

Som i forsøg 4) gentages dette, men dog med koldere vand, for at se om en koldere temperatur har indflydelse på antal kolonier.

Vandet blev målt til 3-5° C.

Alle flaskerne kom i en balje med sne, udenfor (ca. minus 2° C), for at køle vandet HELT ned. Natten over stod de stadig i sne, dog i køleskabet.

Inden filtreringen næste dag, blev temperaturen målt til 2° C og stod til de blev 6° C inden de blev filtreret.

Pladerne blev behandlet som i forsøg 4), se resultat skema.

Fra min 10² opslæmning blev 100m l ud sået på en blå plade(SSI), for at kontrollere antal kolonier pr ml.

 

5 forskellige E. coli stammer (1-5) blev opslæmmet til 50 bakterier/100 ml postevand.

Flaskerne blev stillet på køl et døgn, dyrkes fra 2-3° C direkte ind i 37° C og 44° C.

Der blev lavet en opslæmning svarende til 10² bakterier pr. ml. af alle 5 E. colier.

5 flasker blev tilsat natriumtiosulfat 10%, og tilsat 300 ml. postevand i hver flaske.

Derefter blev der tilsat 1,5 ml. af 10² opslæmningen af henholdsvis bakterie 1-5 i hver flaske.

Flaskerne blev sat på køl i et døgn.

Dagen efter blev temperaturen målt til 8° C, inden 100 ml. blev filtreret to gange fra hver flaske. Filtrene blev lagt på hver deres blå plade(SSI), hvor af den ene kom ind i 37° C og den anden i 44° C i to døgn.

 

De sidste E. coli (5-10), skal også undersøges for vækst ved forskellige behandlinger.

Ud fra hver E. coli, blev der lavet en opslæmning 10⁴ /ml og 10² /ml.

Vandet blev målt til 0-2° C, bakterierne stod i dette i 5-10 min.

100m l blev udtaget fra 10⁴ /ml og 10² /ml af hver E. coli. Dette blev ud sået på fire blå plader(SSI) som henholdsvis kom i 37° C varmeskab og 44° C varmeskab i to døgn.

Dette blev gentaget efter tre timer, hvor opslæmningerne blev målt til 0-2° C.

Pladerne stod i varmeskab i to døgn. Til næste dag, stod opslæmningerne i et balje med sne, i køleskabet.

Temperaturen blev målt til 2-5° C og ud såede igen 100m l fra 10⁴ /ml og 10² /ml fra E. coli 5-10 på 4 plader, fra hver opslæmning. Disse kom henholdsvis i 37° C, i 44° C, i 44V efter 3 timer ved 37° C og i 44° C efter 3 timer ved stue temperatur.

 

 

Nedenstående resultater var ens for både demineraliseret vand, natriumklorid og postevand.

Opløsningen som var beregnet til 1 bakterie/100 ml vand, og dyrkede pladerne ved 37 ° C: ca. 50 kolonier på pladen dagen efter. Ingen vækst ved 44° C.

Opløsningen som var beregnet til 10 bakterie/100 ml vand, og dyrkede pladerne ved 37 ° C: >50 kolonier. Ringe vækst ved 44° C.

Opløsninger som skulle svare til 100 bakterier /100 ml vand, og dyrkede pladerne ved 37 ° C: et stort antal kolonier som flød sammen. Ringe vækst ved 44° C.

Ingen vækst ved 37˚C og 44˚C ved brug af rent postevand uden natriumtiosulfat 10%.

Tabel nr. 2. Aflæsning af Søvands filtrering:

a. isoleres til 44˚C hvor de voksede.

Række 1 : Alle 5 glas er slået om, dvs. At der er vækst.

Række 2 : 4 glas er slået om.

Række 3 : 2 glas er slået om.

Resultat : 5, 4, 2 = 221 MPN » 57-698 kolliforme pr. 100 ml vand. (aflæsning bilag 2) Omslåning af glas se bilag 4 a.

Resultat : 4,1,0 =17 MPN » 5-46 termotolerante bakterier pr. 100 ml vand.(aflæsning bilag 2)

Tabel nr. 3 Inkubation ved 37° C : Aflæsning af Natriumtiosulfat 10 % forsøg:

Tabel nr. 4 Inkubation ved 44° C :

4) Vand prøverne blev målt til 8° C før filtreringen. Her havde de stået i køleskabet i ca. 3 timer.

Tabel nr. 5 Antal kolonier ved forskellige opløsninger og behandlinger :

Tabel nr. 6 Kontrol med E. coli 1.

6) Vand prøverne blev målt til 2° C før filtreringen. Her havde de stået i køleskabet, i en balje med sne i ca. 24 timer.

Tabel nr. 7 Antal kolonier ved forskellige opløsninger op behandlinger inden dyrkning ved 44° C i 2 døgn

Tabel nr. 8 Kontrol med E. coli 1.

Ekstra flaske for at følge vækst afhængig af temperaturen. Aflæses antal kolonier:

Tabel nr. 9 Opslæmning af bakterie nr.1 til 50/100. i koldt vand ved 5° C.

Tabel nr. 10 Kontrol med E. coli 1.

7) Inden filtrering havde prøverne stået et døgn, og var 8° C.

Tabel nr. 11 E. coli 1-5 opslæmmet 50/100 filtreres til 37° C og 44° C

Kontrol med E. coli 1. ; 100 m l af 10² på blå plade = 10 ko0lonier » 100 kolonier/ml.

8) Aflæsninger af kolonier. Ud såning på dag 1 efter 5-10 min i 0° C vand :

Tabel nr. 12 100 m l af E. coli nr. 6 til 10 efter 2 døgn ved forskellige behandlinger.

Tabel nr. 13 Aflæsninger af kolonier. Ud såning på dag 1 efter 3 timer i 0° C vand :

8) Aflæsninger af kolonier. Ud såning på 2. dag efter opbevaring ved 0-2° C vand :

Tabel nr. 14 Udsåning af 100m l fra opslæmning 10⁴ /ml og 10² /ml fra E. coli 5-10

Kolonier på filter, dyrket på blåplade, se bilag 4 b.

I forsøget undersøges Grønlands udvidet MF-metode til påvisning af termotolerante bakterier, da denne erstatter dansk standard metoderne MF- og MPN-metoden i Grønland. Der blev i dette forsøg dog kun anvendt 10 E. coli stammer, hvilket er for lidt til at kunne acceptere denne metode som erstatning.

Der blev regnet frem til en fortynding med en E. coli bakterie, svarende til 1 bakterie/100 ml vand. Antallet blev regnet ud fra en Mac Farland 0,5 som svarer til 10⁸ bakterier pr 1 ml vand. Det er svært at regne i ANTAL bakterier pr. ml. vand, da der er forskel i størrelsen på hver enkel bakterie, og en Mac Farland fortynding er derfor individuel og kan ikke regne med, at der er det samme antal bakterier i de forskellige fortyndinger. Samtidig er der en usikkerhed på det apparat som måler Mac Farland fortyndingerne, og det vil derfor kunne svinge en del. Dette er forklaringen på, at der er flere kolonier tilstede på filtret end beregnet. Men så længe der er et antal som man kan tælle, og at mængden er ens hver gang, er dette tilfredsstillende!

Da opløsningen som var beregnet til 1 bakterie/100 ml vand var filtreret, og dyrket ved 37° C, var der ca. 50 kolonier på pladen dagen efter. Opløsningen som skulle svare til 100 bakterier / 100 ml vand, viste et stort antal kolonier som flød sammen, efter en dag ved 37˚C.

Der blev filtreret to gange af henholdsvis fortyndingerne svarende til 1, 10 og 100 bakterier / 100 ml vand, og den ene blev sat i 37° C, og den anden i 44° C. På dag 1 og dag 2 ses tydeligt, at væksten ved 44° C var meget ringe og ved 1 bakterie /100 ml vand, var der slet ingen vækst ved 44° C, med god vækst ved 37° C. Der var samme vækst ved de tre forskellige fortyndingsmidler. Det ses som forventet, at bakterierne dræbes ved brug af rent postevand uden tilsætning af natriumtiosulfat 10%, da kloren påvirker bakterierne. Dette stemmer fint overens med undersøgelsen fra Columbus, Ohio,1996.

Når vi har lavet en Mac Farland fortynding og fortyndet denne ud til 10², udsås fra denne med 1 m l, 10m l (blå øjepodenål) og 100 m l blå plade. Så kan bakterierne tælles dagen efter, og så kan vi jo gange det op til det antal ml vi har i vores opslæmning til filtrering , så skulle antallet gerne stemme overens! Så vides det hvor mange bakterier der er i fortyndingerne, når nu man ikke helt kan regne med Mac Farland!

Her ud fra kunne konkluderes, at et lille antal bakterier pr. 100 ml. var nok, for at få et brugbart resultat. Efter dyrkning af 1 og 10 bakterier pr. 100 ml. vand ved både 37˚C og 44˚C ses en tydelig forskel i antal kolonier, og størrelse af kolonierne. Og ved fortyndingen svarende til 1 bakterie pr. 100 ml vand, var der slet ingen vækst ved 44˚C og kun ved 37˚C. Det vil sige at et stort antal bakterier bliver hæmmet ved en pludselig påvirkning af 44˚C, og når der arbejdes med små mængder pr. ml vand, er der ingen vækst ved 44˚C, og prøven ville derfor i dette tilfælde blive kaldt for falsk negativ.

Resultaterne var ens for alle tre slags fortyndingsmidler, demineraliseret vand, natrium klorid og postevand tilsat natriumtiosulfat 10%. Der kunne derfor sagtens bruges postevand til selve forsøget, hvilket relaterer mere til "virkeligheden", og bakterierne kunne få de forhold der passer bedst muligt på naturens forhold. Dog er postevandet tilsat klor, for at dræbe bakterierne i vandet. Derfor er de autoklaverede flasker tilsat natriumtiosulfat 10% for at binde kloret, så dette ikke påvirker bakterierne til måling, som det også er bevist at det gør i undersøgelsen fra Columbus, Ohio,1996.

I forsøg 3) undersøges hvor lille mængde natriumtiosulfat 10% der skulle til, for at få bundet kloren i postevandet. Dette er relevant, da opløsninger skulle passe bedst muligt på naturens forhold, og ville derfor skulle prøverne påvirke mindst muligt med tilsætningsstoffer. Der blev valgt en høj koncentration af bakterier, for at sikre nogen vækst. Ved alle fortyndingerne kom der vækst, selv helt ned til en tilsætning af natriumtiosulfat 10% på 1 ml. pr. 1000 ml vand, og denne fortynding kunne derfor accepteres til forsøget. Det vides nu at små mængder bakterier helt ned til 1 bakterie pr. 100 ml vand var nok til påvisning af vækst ved 37˚C, og at der kunne bruges almindeligt postevand, kun tilsat 1 ml natriumtiosulfat 10% pr. 1000 ml vand, se tabel nr. 3.

I projektet, forsøg nr. 4), laves fire forskellige opløsninger af E. coli nr.1. Disse påvirkes forskelligt. Opløsningen var 8˚C før filtreringen og her havde de stået i køleskabet i tre timer. Ved alle påvirkningerne, ved alle opløsninger voksede det beregnede antal kolonier frem. Selv ved en påvirkning direkte ind i 44˚C, kom der vækst ved alle opløsningerne. Undtagen ved opløsningen svarende til 1 bakterie pr 100 ml, men dette kunne lige så godt være et tilfælde når det er så lille en koncentration af bakterier. Opslæmningerne med demineraliseret vand, var taget med som en kontrol på de andre opslæmninger med postevand, og en kontrol på E. coli nr.1, på at der ville være vækst af denne, i vand uden klor. Men væksten var fin både med demineraliseret vand og med postevandet, se tabel nr. 5.

Dette forsøg sammenholdes med forsøg 6), hvor det samme gentages, se tabel nr. 6. Dog er E. coli 1 påvirket helt ned til 2˚C i 24 timer. Her ses tydeligt en forværring i væksten af kolonierne, når pladerne påvirkes ved 44˚C. De overlever når de kun påvirkes i 37˚C, men dræbes faktisk helt ved direkte påvirkning af 44˚C. Man skal helt op på en fortynding svarende til 100 bakterier pr 100 ml vand, før der er et lille antal der ikke er hæmmet. En opvarmning af pladerne med filtre i en time ved stue temperatur eller ved 37˚C er ikke nok til at fremme væksten. Opvarmes pladerne i 3 timer ved stue temperatur eller ved 37˚C fremmes væksten dog, men er stadig ikke optimal. Den målte temperatur på 2˚C før filtreringen ville svare til vinter temperaturen på prøverne i Grønland, og i forsøg 4) hvor prøverne var 8˚C, ville det svare til sommer perioden i Grønland. Vinterperioden er den længste på Grønland, og det vil derfor være et problem over længere tid, at påvise en fækal forurening i vandet ved 44˚C.

I forsøg 1) og 2) bruges søvand , der var i forvejen fundet E. coli i, og var derfor interessant at inddrage i dette projektet, for at sammenholde MF-metoden og MPN-metoden, på "virkeligheden". Pladerne blev behandlet forskelligt under MF-metoden, for at undersøge under hvilke forhold vi kunne få vækst, se tabel nr.1 og MPN-resultater. Søvandet var 0˚C ved prøvetagningen, og 6-7˚C ved filtreringen. Efter indkubering ved 37˚C og 44˚C efter forskellige behandlinger, var den eneste plade der var vækst på, den der var dyrket direkte ved 37˚C. På de andre plader, blev bakterierne hæmmet ved påvirkning af 44˚C. På pladen dyrket ved 37˚C isoleres nogle af de total koliforme og dyrkes ved 44˚C, hvor de forgærede laktose om dannede indol. Vi fandt at det var en E. coli, altså termotolerante bakterier, og der var derfor tale om en fækal forurening. Denne var ikke fundet dyrkning ved 44˚C.

I forsøg 2), MPN-metoden, ses efter dyrkning af de glas med søvand og agar ved 37˚C, et resultat svarende til MPN=221 = 57-698 koliforme bakterier pr 100 ml vand. Derefter dyrkes de positive glas videre i 44˚C og fandt et resultat svarende til MPN=17 = 5-46 termotolerante bakterier pr. 100 ml vand. Dette stemmer fint overens med Grønlands MF-metoden, hvor der ses et resultat på 25 total koliforme bakterie pr. 100 ml vand, se tabel nr.2. Dog kan vi ikke være sikre på, at alle 25 er termotolerante, da man så skulle isolere hver enkel koloni for sig selv.

Det vides nu, at MF-metoden kunne påvise termotolerante E. coli, hvis temperaturen af prøven ikke var for kold, og at en lav temperatur ville hæmme eller måske dræbe termotolerante bakterier.

Ved begge metoder kan det påvises om bakterien er laktose positiv eller negativ, men MF-metoden har mere præcise resultater, da man kan tælle antal kolonier direkte fra pladerne, og arts identificere dem, hvor man ved MPN-metoden blot kan se: vækst eller ikke vækst. Ved MF-metoden vil man kunne se de laktose negative bakterier, hvilket man vil overse ved MPN-metoden, da der ikke sker et farve omslag i den flydende agar fra lilla til gult, og det er trods alt 11% af E. coli stammerne der er laktose negative (15). Det menes dog, at der altid vil være laktose positive E. coli sammen med laktose negative E. coli, sådan så der vil ske et farve omslag alligevel. Men Peter Poulsen har fundet laktose negative E. coli uden tilstedeværelse af laktose positive E. coli.

MF-metoden er hurtigere at lave, og der er ikke så stor risiko for forurening af prøverne, gennem pipette spidse og lignende. Dog kan MPN-metoden lettere påvise små mængder fækal forurening, da prøven er omgivet af agar, og giver derfor bedre vækstmuligheder. Dette sammenholdes med undersøgelserne fra Canadian Shellfish Quality Ressource, hvor de også fandt at MF-metoden var bedre, til at finde og tælle det nøjagtige tal.

I forsøg 5), se tabel nr. 9, undersøges hvor lang tid en E. coli skulle påvirkes af det kolde vand, før den blev hæmmet, laves en fortynding svarende til 50 bakterier pr. 100 ml vand og der filtreres 100 ml fra den efter en time, to og tre timer på køl. Disse få timer havde ikke en individuel forskel på bakterierne, det ses af tabel nr. 9, en halvering i kolonierne fra vækst ved 37˚C til vækst ved 44˚C, se tabel nr. 9. Men vandet bakterierne blev opslæmmede i, var også ca. 5˚C, så måske var det ikke nået at blive kølet ned til en så kold temperatur nær frysepunktet, at bakterierne blev hæmmet inden de blev sået ud. Men i forsøg 8) opslæmmes E. coli 6-10 i vand som var 0˚C, og ud fra disse resultater ses en tydeligt hæmning af bakterierne allerede efter 5-10 min, se tabel nr. 12. Og efter tre timer ses det samme, se tabel nr. 13.. Ved 10² kom der kun vækst af gennemsnitlig 5-6 bakterier, hvor den beregnede værdi var 10 kolonier, dette kunne også være et tilfælde, men det sammenholdes så med det store fald i antal kolonier ved 10⁴ , hvor der kun kom vækst af gennemsnitlig 250 bakterier, hvor det beregnede resultat ville være 1000 kolonier. Dette er ens ved både 37˚C og 44˚C, så her er det ikke dyrkningstemperaturen der spilder ind, men hæmning af bakterier på grund af det kolde vand. Efter et døgn, hvor prøverne var opbevaret ved 0-2˚C, dyrkes de igen, men pladerne behandles forskelligt. Her ses tydeligt, hvilket der også ses efter 5-10 min og 3 timer, at reaktionerne også forskellige for hver E. coli stamme, se tabel nr. 14. Alle E.coli stammerne er svækket, undtagen E. coli nr. 9. Ved alle behandlingerne af pladerne ses den beregnede vækst; 10² = 10 kolonier, 10⁴ = 1000 kolonier. Dette var også tilfældet efter 5-10 min. og 3 timer. Denne E. coli er meget hårdføre, men det ses dog, at der er et fald i koloni antal ved en direkte påvirkning af 44˚C på 75%. Dette er meget af en så robust bakterie. E. coli nr. 6 er næsten helt hæmmet, og selv ved store mængder, er kun lille vækst. Ved opslemning10² ses der ingen vækst af E. coli nr. 7, 8 og 10 ved direkte påvirkning af 44˚C, det kan de simpelthen ikke tåle, når de er kølet helt ned til frysepunktet. Ved opslæmningen 10⁴ for de samme bakterier ses en meget nedsat vækst ved samme påvirkning. En opvarmning ved stue temperatur og ved 37˚C i tre timer forbedrer væksten lidt ved 44˚C. Men denne opvarmning har ingen betydning for mængden af fremvoksne E. coli kolonierne 7, 8 og 10 ved en opslæmning på 10². Her er antallet for lille, og alle bakterierne er hæmmet.

Ud fra MF-metoden kunne der påvises termotolerante bakterier, hvis temperaturen af prøven ikke var for kold, da en lav temperatur ville hæmme eller helt dræbe termotolerante bakterier. En fækal forurening er derfor svær at påvise om vinteren ved en MF-metode, hvis pladerne efter forskriften skal dyrkes direkte i 44˚C (bilag 3). Hvis man benytter Grønlands MF-metode, og præ inkuberer de dyrkede plader ved 37˚C i mindst tre timer, eller op til et døgn, kan denne bruges til påvisning af enterokokker, som allerede beskrevet i dansk standard og til E. coli som man gør det nu i Grønland. En fækal forurening skal påvises kort tid efter forureningen er sket, for ellers hæmmes bakterierne så meget i det kolde vand, at de ikke kan dyrkes ved 44˚C.

MPN-metoden er god til at påvise termotolerante bakterier, men samme problem er gældende her, at bakterien ikke må være for kold. MPN-metoden giver bedre vækst mulighed for bakterierne, da de her er omsluttet af agar/vækstmedie, men MPN-metoden er lettere at forurene end MF-metoden, da der benyttes pipette spidse og forskellige glas. Her vil man heller ikke kunne se antal kolonier, som ved MF-metoden.

MPN-metoden vil dog ikke påvise de laktose negative E. coli stammer, da man kigger efter et farve omslag i agaren. Disse laktose negative stammer vil findes ved Grønlands MF-metoden, da de gror frem og man kan se dem, og videre isolere dem.. For at opnå bedst mulig vækst af termotolerante bakterier bør pladerne inkuberes i 37˚C i mindst tre timer, før inkubation ved 44˚C, eller dyrkes ved 37˚C i et døgn, og total koliforme bakterier isoleres til 44˚C, se tabel nr. 5 og 7.

Denne undersøgelse gav et indblik i E. coli stammer ved påvirkning af forskellige temperatur. Samtidig fik vi et indblik i to kendte, forskellige metoder til at påvise fækal forurening ved 44˚C. Disse sammenholdes med Grønlands udvidet MF-metode, som påviser både enterokokker og E. coli.Der er fordele og ulemper ved alle metoder, og det er derfor langt fra bevist, hvilken en af metoderne der er bedst egnet. Forsøget har dog giver en ide om, hvilke forhold der skal tages hensyn til, i et land som Grønland, hvor der gennem året er stor forskel på temperaturen i vandet, hvilket har medført til brug af den udvidede MF-metode.

Til en undersøgelse af samme størrelse, hvor det skal konkluderes hvorvidt man kan nøjes med en udvidet MF-metode som man bruger i Grønland, i stedet for brug af begge dansk standard metoder til påvisning af enterokokker og E.coli, ville det være mere passende med flere E. coli stammer indblandet, så resultaterne ikke kan skyldes tilfældigheder. Samtidig bør der udføres flere forsøg med MPN-metoden, så denne kan sammenholdes med alle MF- forsøgene.

Valg af enten dansk standard metoderne; MF- metoden og MPN- metoden eller Grønlands udvidet MF-metode er nok også et spørgsmål om tålmodigheds grænser, tid og overblik, da Grønlands MF-metoden er langt hurtigere og lettere end Dansk standard metoder.

                                                                        Charlotte Olsen

Efter følgende gjort forsøg med yderligere 54 E. coli stammer, dette bekræfter som projektet viser at kolde E.coli er svære at påvise.

opslæmning af 1000 cfu / ml disse opbevares ved 0 - 2 grader i et døgn herefter udsåes 100 mikroliter, således at det forventede koloni antal skal være 100. For hver stamme er der udført kontrol ved opslæmning  fra 8 grader, alle kontoller ligger i intervallet  75 - 125 kolonier.

Ved usåning fra 2 grader til 37 grader findes 26 stammer eller 48 % at være upåvirkede.

Ved udsåning fra 2 grader til 44 grader findes 6 stammer eller 11 % at være upåvirkede.

11 stammer eller 20 % kan overhovedet ikke vokse ved 44 grader.

Det skal erindres at vi i praksis skulle kunne detektere helt ned til 1 cfu / 100 ml

1) Dansk standard, Vandundersøgelse – Bestemmelse af coliforme bakterier og termotolerante coliforme bakterier – Fortyndingsmetoden (MPN-metoden), København DA projekt : 48508

2) Chapter 10 – Microbiological analyses, http://www.who.int/docstore/water_sanitation_health/wqmonitor/ch12.htm, J. Bartram and S. Pedley

7) www.mst.dk

13) http://www.shellfishquality.ca/indicators.htm

14) http://oh.water.usgs.gov/reports/111/rpt96.4199.html

18) http://www.alternativ-behandling.dk/SABhjemmeside/sidste%20nyt/levende.vand.html

19) http://www.foedevaredirektoratet.dk/FDir/Publications/1997091/indhold/8.asp

20) http://www.frederikssundvand.dk/Vandanalyse.htm

21) http://www.gammelsoe-vandvaerk.dk/S%C3%A5dan_l%C3%A6ses_en_vandanalyse.htm

22) Charlotte Birk Olsen, bioanalytiker underviser Næstved KMA.